Juana Del Río se aventurou nas artes cênicas como bailarina entre 2000 e 2008, antes de ingressar no teatro. Formou-se pela Escuela de Teatro Nacional da Colômbia em 2012 e participou de obras como Mentiras, El Musical, oito temporadas de El Bolero de Rubén e cinco temporadas de Catatonia, ambas do Festival Ibero-Americano de Teatro de Bogotá em as edições de 2014 e 2016 respectivamente.
Iniciou sua carreira audiovisual na série La Ley del Corazón. Sua interpretação de Maria Fernanda, uma mulher transgênero, lhe rendeu vários prêmios, como o Prêmio ACA Colombian Actors Association de Melhor Nova Atriz e uma indicação no Festival de Cartagena.
Em 2018, interpretou a detetive Helena Poveda, personagem principal da série original Netflix Frontera Verde, dirigida por Ciro Guerra, Jacques Toulemonde e Laura Mora. Protagonizou a série La Ley Secreta, produzida pela Caracol Televisión e adquirida pela Netflix, que estreou em setembro de 2019. Foi o personagem antagônico de Amar y Vivir da FOX Telecolombia, que estreou na Caracol TV em janeiro e na Netflix em julho de 2020 No primeiro semestre daquele ano, co-estrelou com Joong-Ki Song o filme coreano Bogotá, dirigido por Seoung Je Kim.
